En un estudio reciente publicado en bioRxiv*Servidor de preimpresión Los investigadores han identificado un producto de gen viral, el factor aditivo, marco de lectura abierto 7a (ORF7a), que facilita la evasión inmune del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2) al reducir la expresión superficial del complejo de compatibilidad Principal histológico (MHC) moléculas de clase I.

antecedentes

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) juegan un papel vital en la eliminación de las células infectadas por SARS-CoV-2, mediada por el reconocimiento de péptidos derivados del virus presentados a las moléculas MHC de clase I. Para contrarrestar estos efectos antivirales, muchos virus han desarrollado mecanismos para interferir con la presentación de antígenos al inhibir la síntesis y degradación de moléculas MHC de clase I a través de proteosomas virales. Los virus reducen la presentación de antígenos de la superficie celular del MHC de clase I, lo que interfiere con el reconocimiento viral por parte de los CTL.

sobre estudiar

En este estudio, los investigadores evaluaron si el SARS-CoV-2 desarrolló mecanismos para contrarrestar la actividad de CTL al interferir con la vía de clase I del antígeno leucocitario humano (HLA).

Las células Vero E6 se infectaron con la cepa SARS-CoV-2 NL/2020 y la expresión de MHC de clase I se evaluó realizando un análisis de citometría de flujo 1 o 2 días después de la infección (dpi). El efecto de la infección por SARS-CoV-2 se evaluó en células epiteliales basales alveolares humanas (A549) transfectadas con serina proteasa 2 de membrana (TMPRSS2) y enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). Posteriormente, las células fueron desafiadas con la cepa SARS-CoV-2 NL/2020.

Para determinar la expresión de HLA-I de la molécula SARS-CoV-2 que regula la superficie de HLA-I, se transfectó una biblioteca de ácido desoxirribonucleico (ADNc) viral complementario etiquetada con StrepII en células 293T, después de lo cual se determinó la expresión de HLA-I en la superficie. medido por ensayo de citometría de flujo. Además, ORF7a (ADNc) se clonó en otro vector lenticular para validar los resultados del estudio.

Además, para evaluar si ORF7a regula a la baja la expresión de HLA clase I en la superficie celular o afecta la expresión de proteínas de la vía secretora, se controló la expresión de varios antígenos en la superficie de células 293T transfectadas con ORF7a. A continuación, el equipo evaluó si ORF7a regula HLA-I entre diferentes linajes celulares, para lo cual se transfectó ORF7a en líneas celulares como MelJuSo (melanoma cutáneo), HK-1 (carcinoma nasofaríngeo) y Huh7 (carcinoma de piel). hepatocitos).

Para identificar los dominios ORF7a vitales para la regulación negativa de HLA-I, se generaron tres cepas mutantes de SARS-CoV-2 reemplazando la secuencia del péptido ORF7a con la secuencia de un conjunto humano de diferenciación 8A (CD8A), mutando los motivos ER de recuperación terminal (ORF7a -mutante de cola).), eliminando toda la cola y la membrana citoplásmica.

Para identificar los cambios de aminoácidos (aa) responsables del fenotipo de ganancia de función de SARS-CoV-2 ORF7a, se generaron dos mutantes quiméricos introduciendo tres cambios de aa en la secuencia de SARS-CoV-1 ORF7a. Para evaluar si la fenilalanina en la posición 59 en SARS-CoV-2 ORF7a está presente en otros sarcovirus, se realizó la alineación de secuencias de proteínas.

Para evaluar si ORF7a conduce a la regulación a la baja de la superficie de HLA clase I por proteólisis, el equipo evaluó si el grupo total de HLA-I (expresión superficial e intracelular) se agotó con la expresión de ORF7a en células 293T. Para evaluar si p97 o el proteasoma están involucrados en la regulación de la reducción de la superficie de HLA-I mediada por ORF7a, las células 293T transfectadas con ORF7a se trataron previamente con MG132 (un inhibidor del proteasoma) o CB 5083 (un inhibidor de p97) antes de evaluar el HLA superficial e intracelular. expresión. Se realizó un análisis de inmunoprecipitación para evaluar si ORF7a estaba directamente relacionado con la expresión de HLA-I.

consecuencias

La expresión superficial de MHC de clase I en células que expresan pico (S) de SARS-CoV-2 y células transfectadas se reguló al alza a una resolución de 2 ppp. La infección por SARS-CoV-2 también redujo la expresión superficial de MHC clase I en las líneas celulares analizadas. En el análisis de citometría de flujo, para todos los ADNc virales, solo ORF7a y sus construcciones redujeron significativamente la expresión superficial de HLA-I. Tanto el ORF7a sin etiquetar como el HLA-I etiquetado con StrepII indujeron una fuerte regulación positiva de la superficie celular, un efecto que no se observó en ORF8 debido a la reducción de los niveles de proteína de ORF8. Sin embargo, la regulación a la baja de HLA-I fue transitoria y el fenotipo se perdió después de ~ 14 días. ORF7a no afectó la expresión de CD9, CD49b, CD46 y CD58 de las células 293T, lo que indica la acción específica de ORF7a.

El dominio transmembrana y la secuencia del péptido ORF7a fueron esenciales, mientras que el modelo de recuperación de ER fue consumible para la regulación negativa de HLA-I. La transferencia de la región luminal II del ORF7a del SARS-CoV-2 al ORF7a del SARS-CoV-1 y al ORF7a simulado T59F/H62Q/A68P redujo significativamente la regulación de la expresión de HLA-I en la superficie celular.

La mutación T59F provocó un fenotipo de ganancia de función de SARS-CoV-2 ORF7a y HLA clase I de la superficie celular. La mutación se detectó en todos los aislamientos del virus Sarpic. La posición 59 de ORF7a mostró una variabilidad significativa entre los aislados virales. Sorprendentemente, la expresión intracelular de HLA de clase I se reguló potentemente en células 293T que expresan ORF7a a los siete y 21 ppp, mientras que la expresión superficial de HLA de clase I se reguló a la baja.

Las imágenes de inmunofluorescencia de células MelJuSo transfectadas con ORF7a indicaron que HLA-I se acumulaba en el RE alrededor del núcleo y posiblemente en el compartimento intermedio del RE-Golgi (ERGIC). El tratamiento con los inhibidores de MG132 o p97 abolió la regulación negativa de la superficie celular HLA-I mediada por ORF7a sin afectar la expresión intracelular de HLA-I, lo que indica que la regulación negativa mediada por ORF7a de la superficie celular HLA-I dependía de p97 y del proteasoma. Se observó una coprecipitación fuerte y específica de ORF7a y HLA-I en el análisis de inmunoprecipitación.

conclusión

En general, los resultados del estudio mostraron que el SARS-CoV-2 puede interferir con la presentación de antígenos y evitar la vigilancia inmunológica. Al regular a la baja la expresión de HLA-I y la presentación de antígenos, ORF7a facilita la evitación de las respuestas de linfocitos T citotóxicos por parte del SARS-CoV-2.

*Nota IMPORTANTE

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no están sujetos a revisión por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.